Molecular Cell | 抑制线粒体自噬促进帕金森疾病发展

线粒体自噬是一种选择性清除功能失调线粒体的过程，是线粒体质量控制的核心机制。线粒体自噬失调与一系列人类疾病有关，包括神经退行性疾病、心血管疾病、衰老。PINK1是一种具有线粒体靶向序列和跨膜结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶，而Parkin则是一种胞质泛素E3连接酶。二者均是公认的线粒体自噬调节因子，负责维持线粒体质量控制。编码PINK1和Parkin的基因发生突变与帕金森病（PD）有关。

近期，韩国首尔国立大学分子生物学与遗传学研究所Jongkyeong Chung研究团队在Molecular Cell发表了《Mitochondrial fumarate inhibits Parkin-mediated mitophagy》，探究了三羧酸（TCA）循环产生的代谢物富马酸作为PINK1 - Parkin介导的线粒体自噬关键调节因子的潜在作用。研究表明，这种修饰特异性地作用于人类Parkin蛋白中半胱氨酸323和451残基的巯基，导致其线粒体定位和E3连接酶活性受到抑制，从而阻碍PINK1 - Parkin介导的线粒体自噬。研究发现，人类Parkin蛋白中可发生琥珀酰化的半胱氨酸在包括果蝇在内的无脊椎动物中并不保守。为了评估Parkin蛋白琥珀酰化的功能影响，研究团队构建了具有可发生琥珀酰化半胱氨酸的Parkin基因敲入果蝇。当这些果蝇暴露于高水平的富马酸时，会表现出明显的帕金森病（PD）相关表型。

接着研究团队检测了HEK293细胞中的内源性富马酸水平。与表达对照siRNA的细胞相比，表达FH siRNA的细胞显示出富马酸水平升高，内源性FH蛋白水平降低。相反，SDHA敲低略微降低了富马酸水平，并且在表达FH siRNA的细胞中观察到的升高的富马酸水平在与SDHA siRNA共表达时降低。研究人员还利用基因敲除模型证明了富马酸水平升高对线粒体自噬的抑制作用仅发生在内源性PINK1和Parkin存在的细胞中。此外，用FH抑制剂处理也会抑制线粒体自噬。为了监测Parkin向线粒体的转位，研究人员使用了稳定表达GFP - hParkin的HeLa细胞。CCCP处理后，Parkin从细胞质转位到线粒体。然而，尽管有CCCP刺激，但与DMF共同处理可阻止Parkin向线粒体的转位。同样，在CCCP处理的情况下，与富马酸、MMF和FH抑制剂共同处理会阻断Parkin向线粒体的转位。以上结果表明富马酸选择性地损害PINK1 - Parkin依赖性线粒体自噬。进一步研究发现，FH缺乏会抑制线粒体自噬，而细胞质或线粒体中FH的表达会促进Parkin介导的线粒体自噬，这可能是通过降低细胞质和线粒体中的富马酸水平实现的。

为了研究富马酸对线粒体自噬的调控机制，研究人员制备了一种2SC抗体来检测蛋白质的琥珀酰化。研究人员使用该抗体，仅在富马酸处理的样本中检测到了2SC修饰的Parkin蛋白。研究人员在表达FLAG标签人Parkin蛋白（hParkin）的HeLa细胞中敲低VDAC1和VDAC2后，检测了Parkin蛋白的琥珀酰化情况。在用FH抑制剂处理时可检测到Parkin蛋白的琥珀酰化，进一步敲低VDAC1或VDAC2会使其减少。当VDAC1和VDAC2都被敲低时，则检测不到Parkin蛋白的琥珀酰化。在ANT1敲除的HEK293细胞中，研究人员将外源性ANT1野生型或ANT1突变体与FH siRNA共转染，观察Parkin蛋白的琥珀酰化情况。在转染了FH siRNA的ANT1敲除HEK293细胞中未检测到Parkin蛋白的琥珀酰化。然而，当这些细胞中表达ANT1野生型或突变体时则可观察到Parkin蛋白的琥珀酰化。这些结果表明，Parkin蛋白的琥珀酰化是细胞内富马酸水平升高时以依赖VDAC1/2和ANT1的方式发生的。研究人员接着通过一系列实验，确定了Parkin蛋白琥珀酰化位点，证实了Parkin蛋白在半胱氨酸323和451位点被富马酸特异性地琥珀酰化，富马酸通过使Parkin发生琥珀酰化来抑制Parkin依赖性线粒体自噬。此外，Parkin蛋白中半胱氨酸323位点的琥珀酰化会抑制其与磷酸化泛素（pUb）的相互作用，而半胱氨酸451位点的琥珀酰化则会破坏底物结合。这两个半胱氨酸位点中任意一个发生琥珀酰化，都会干扰Parkin蛋白C431位点泛素硫酯键的形成，这使得Parkin无法顺利定位至受损线粒体表面，自噬过程进而受到阻断。

为了探究 Parkin 蛋白琥珀酰化在体内的影响，研究人员通过将 dParkin 的 Y344 和 T469 残基替换为半胱氨酸，生成了 parkin^YCTC 敲入（KI）果蝇。Parkin KI 果蝇的存活率降低，并表现出与帕金森病（PD）相关的表型，包括运动能力受损以及多巴胺能神经元数量减少。这些表型在 Parkin 缺陷型果蝇中更为严重。给 Parkin KI 果蝇喂食DMF会加重与 PD 相关的表型，且运动能力和多巴胺能神经元数量下降更明显。给 Parkin 敲除（KO）（park¹）和 w¹¹¹⁸ 果蝇喂食 DMF 并未使表型恶化，这表明富马酸水平升高通过 Parkin 蛋白的琥珀酰化加重了与 PD 相关的缺陷。

为了进一步探究富马酸在 PD 发病机制中的作用，研究人员通过将 Parkin KI 果蝇与 SDH、FH 和VDAC RNAi 果蝇杂交，对 Parkin KI 果蝇体内的富马酸盐水平进行遗传调控。结果，与 Parkin KI 果蝇（TH>GFPi，parkin^YCTC）相比，与 FH RNAi（TH>FHi，parkin^YCTC）杂交的 Parkin KI 果蝇在 PPM1/2 和 PPL1 区域的运动能力和多巴胺能神经元数量下降更明显。相反，将 Parkin KI 果蝇与 SDH RNAi（TH>SDHi，parkin^YCTC）或 VDAC RNAi（TH>porini，parkin^YCTC）果蝇杂交，以降低富马酸水平或阻止富马酸盐从线粒体定位到细胞质，运动能力和多巴胺能神经元数量的下降得到恢复。总之，这些结果表明，富马酸水平和 Parkin 蛋白的琥珀酰化在果蝇中诱导与 PD 相关的发病机制中起着关键作用。

总的来说，该研究结果强调了富马酸作为PINK1 - Parkin介导的线粒体自噬内源性调节因子的重要性，为线粒体代谢活动与帕金森病病理之间的复杂相互作用提供了新的见解，深化了对线粒体自噬调控机制的理解，也提示了代谢物在衰老与疾病发生发展中的重要作用。未来，思考如何调控线粒体自噬，是成为帕金森病等疾病的潜在治疗方向。