Nature Communications | 激活自噬逆转干细胞功能衰退

许多组织中干细胞的功能衰退是衰老的一个标志。肠道干细胞（ISCs）是成年果蝇肠道中唯一能够根据生理需求进行分裂的细胞类型。与哺乳动物一样，果蝇肠道的上皮细胞更新也由ISCs维持。在衰老过程中，肠道上皮会发生发育异常，其特征是ISCs过度增殖和分化错误。

越来越多的证据表明，自噬能力会随着年龄的增长而下降，自噬功能受损与干细胞衰老有关。在小鼠中，肌肉干细胞的再生能力由基础自噬维持，其调节异常会导致干细胞过早进入不可逆的衰老状态。同样，自噬基因如Atg5和Atg7对于ISCs的维持和肠道稳态是必需的。在果蝇中，自噬缺陷的ISCs在衰老过程中表现出DNA损伤增加和细胞周期停滞，并导致ISCs无限增殖或凋亡。这些结果揭示了自噬在维持肠道上皮细胞持续更新所需的干细胞正常功能方面的关键作用。

近期，同济大学生命科学与技术学院Hansong Deng研究团队在Nature Communications发表了《Restoring calcium crosstalk between ER and mitochondria promotes intestinal stem cell rejuvenation through autophagy in aged Drosophila》，报告了钙网络的崩溃与细胞衰老密切相关。果蝇衰老ISCs中，胞质钙（CytoCa^{2 +}）水平升高，而线粒体钙（MitoCa^{2 +}）水平降低，且这与代谢转变有关。研究团队发现通过基因手段恢复线粒体钙水平，可以激活老年果蝇的自噬作用，从而逆转肠道干细胞的功能衰退，并促进肠道内稳态。进一步的研究表明，线粒体钙和线粒体 - 内质网接触点（MERCs）通过 IP3R 形成一个正反馈回路，以不依赖 AMPK 的方式调节自噬。在老年果蝇中，这个回路的崩溃导致线粒体钙水平降低和肠道干细胞功能障碍。

既往研究结果显示，老年ISCs中的线粒体Ca²⁺含量降低，而细胞质Ca²⁺含量则保持较高水平。研究团队进一步追踪衰老过程中ISC内的细胞内钙模式，发现Ca²⁺稳态的破坏从中年开始。用Ecc15感染后，年轻果蝇ISCs中的细胞质Ca2⁺和线粒体Ca²⁺均显著增加，相比之下，在老年果蝇的ISCs中，感染进一步提高了细胞质Ca²⁺水平，但线粒体Ca²⁺水平仍低于年轻果蝇。这表明老年ISCs中线粒体Ca²⁺对外部刺激的反应能力受损。实验进一步证明，ISCs中的MitoCa²⁺水平受线粒体钙单向转运体（MCU）复合物调控。接着，研究团队采用通过基因手段恢复MitoCa²⁺水平，证明了老年ISCs缺乏有效的MitoCa²⁺摄取，并且通过恢复MitoCa²⁺水平可以改善老年ISC的功能障碍。

而后，研究团队研究了MitoCa²⁺在肠干细胞衰老和肠道功能中的作用。老年肠干细胞中处于G1期、G2/M期的肠干细胞比例显著增加，这表明细胞周期失调。并且，老年肠干细胞中的乳酸水平和DNA损伤均有所增加。在过表达MCU或敲低MICU1基因的老年肠干细胞中，细胞周期失调、乳酸水平以及γ-H2AX积累均得到了恢复。此外，年轻肠干细胞中MCU的敲低表现出与老年肠干细胞相似的特征。由此可见，恢复线粒体Ca²⁺水平可延缓果蝇肠干细胞的衰老并恢复肠道稳态。

图片来源于《Nature Communications》

既往研究结果显示，衰老的肠干细胞中ATP水平降低，而严重的ATP耗竭可能导致细胞凋亡或坏死。但是在衰老的肠干细胞中MCU^OE或MICU1^OE时，凋亡或坏死的肠干细胞百分比基本没有变化。于是，研究团队测试了线粒体钙是否通过调节自噬来延缓肠干细胞衰老。MCU^OE或MICU1^RNAi，肠干细胞中的自噬体数量和酸性溶酶体显著增加。进一步追踪自噬流，在MCU^+-OE的ISCs中，自溶酶体的比例显著增加。在氯喹（CQ，一种自噬体 - 溶酶体融合抑制剂）处理下，MCU^++OE的ISCs中自噬体的积累也有所增加。另一方面，饥饿诱导的mCherry - ATG8a阳性和溶酶体示踪剂阳性点状结构的增加，在MCU^RNAi或MICU1^OE的ISCs中均有所减少。Ref(2)P是一种保守的自噬底物，MCU^OE会显著减少ISCs中Ref(2)P - GFP点状结构的数量，而MICU1^OE则会增加其数量。这些数据表明，果蝇肠道ISCs中的自噬活性对MitoCa²⁺敏感。CQ处理可以完全阻断MCU^OE诱导的ISCs年轻化。当通过Atg1^RNAi干扰破坏自噬时，MICU1^RNAi在老年ISCs中抑制的DNA损伤会被阻断。另一方面，通过在ISCs中特异性过表达Atg17来增加自噬，可抑制老年ISCs中的DNA损伤。总之，这些结果表明，线粒体钙离子介导的抗衰老作用依赖于自噬。

图片来源于《Nature Communications》

既往研究结果显示，接着，研究团队试图阐明MitoCa²⁺刺激自噬的机制。相关实验表明，ISCs中的自噬体起始被MCU^OE显著增加，而内吞作用在ISCs中大多不受MCU^OE的影响。AMPK是自噬的核心调节因子，然而，AMPK活性以及下游mTOR活性在MCU^OE的ISCs中基本正常，通过基因调控MitoCa²⁺水平，ISCs的细胞大小也基本保持不变。同时，尽管发现ISCs中的自噬活性对AMPK和MitoCa²⁺水平都敏感，但抑制AMPK活性可抑制由MitoCa²⁺介导的自噬，反之亦然。过量的活性氧（ROS）水平可通过JNK激活自噬。然而，线粒体ROS（H2O2）水平没有明显增加，并且在MCU^OE的ISCs中JNK活性甚至降低了。果蝇ISCs的内质网（ER）中，主要的钙释放通道是IP3R，Itpr基因编码果蝇基因组中IP3R的唯一同源物。通过ItprRNAi可抑制肠干细胞中的MitoCa²⁺水平，而过表达Itpr则会使其升高，这表明线粒体钙水平与IP3R介导的内质网钙释放相关联。    

通过MICU1^RNAi来增加肠干细胞中的线粒体钙水平可降低ER钙水平，而当同时沉默Itpr时，这种效应会被阻断，这表明增加线粒体钙水平 可通过激活IP3R来促进ER基质中的钙释放。通过饥饿或MICU1^RNAi诱导的肠干细胞自噬也会被Itpr^RNAi抑制，而过表达Itpr则会促进肠干细胞的自噬活性。另一方面，MICU1^RNAi可抑制老年肠干细胞中的DNA损伤，而这种抑制作用会被Itpr^RNAi阻断，并且过表达Itpr足以抑制老年肠干细胞中的DNA损伤。这些结果表明，线粒体钙水平的升高可通过逆向激活IP3R介导的内质网钙释放来促进自噬并延缓肠干细胞的衰老。

MERCs作为内质网和线粒体之间的物理连接，不仅是内质网向线粒体进行动态Ca²⁺转移的场所，也是自噬调节的关键部位。研究团队证明了MERCs参与了MitoCa²⁺介导的自噬调节，MERCs介导的钙信号串扰对于ISCs中MitoCa²⁺介导的自噬至关重要。基因水平上调MERCs可恢复线粒体钙水平，在衰老肠干细胞中，线粒体钙水平降低且对Ecc15感染不敏感。此外，MCU^OE对衰老肠干细胞中DNA损伤的抑制作用可被线粒体-内质网连接蛋白1（Mmm1）^RNAi阻断。MICU1^RNAi对衰老肠干细胞中乳酸水平的抑制作用也可被Grp75^RNAi逆转。有趣的是，hVAPB^OE或Grp75^OE均可使衰老肠干细胞中的DNA损伤、乳酸水平和分化异常恢复正常。此外，过表达连接蛋白-红色荧光蛋白也足以减少衰老肠干细胞中的DNA损伤。以上这些数据表明，MERCs对于线粒体钙介导的衰老肠干细胞年轻化至关重要。

研究人员推测IP3R功能异常和/或MERCs功能障碍导致了老年ISCs中MitoCa²⁺水平的降低。与年轻的ISCs相比，尽管老年ISCs的内质网钙（ERCa²⁺）水平没有显著变化，但在饥饿状态下，老年ISCs的ERCa²⁺反应较差，这表明老年ISCs中IP3R的活性受到了损害。同时，在喂食和饥饿条件下，老年ISCs中标记线粒体 - 内质网关联膜的绿色荧光蛋白点状信号的数量和强度均低于年轻的ISCs，这提示老年ISCs中MERCs的结构遭到了破坏。这些结果表明，在老年ISCs中，MERCs中IP3R介导的钙离子信号串扰的破坏对于MitoCa²⁺水平的降低至关重要。另一方面，与年轻的ISCs相比，在衰老的ISCs中观察到更多的p62聚集体。在喂食和饥饿条件下，衰老ISCs中mCherryATG8a阳性点状结构的数量均低于年轻ISCs。这些结果表明，衰老ISCs的自噬功能受损，且自噬机制对饥饿的敏感性降低。尽管自噬活性降低，但衰老ISCs中的AMPK活性实际上有所增加，这可能是由于衰老ISCs中线粒体Ca²⁺减少导致ATP水平下降所致。通过过表达MCU来增加线粒体Ca²⁺可下调衰老ISCs中的AMPK活性，这表明衰老ISCs的自噬功能障碍并非由于AMPK受到抑制。

有趣的是，通过过表达MCU来增加线粒体Ca²⁺可恢复衰老ISCs中的IP3R活性、MERCs以及自噬功能。同样，过表达Itpr或hVAPB可促进衰老ISCs的自噬活性。这些结果表明，线粒体Ca²⁺、IP3R和MERCs形成了一个正反馈回路，该回路的破坏通过自噬功能障碍触发了ISCs的衰老。

综上，本研究揭示了自噬启动的调节模块，涉及内质网和线粒体之间的钙串扰，恢复内质网与线粒体之间的钙信号交流，可通过激活自噬来逆转干细胞功能衰退，从而改善肠道稳态，本研究为治疗衰老及相关疾病提供了新的策略。